Клеточная кардиомиопластика

Обзорная статья, обобщающая современные данные о клеточной кардиомиопластике - новой терапевтической стратегии лечения сердечной недостаточности. Эксперименты на животных показали возможность увеличения сократительной функции пораженного миокарда при интракардиальной трансплантации различных типов донорских клеток: кардиомиоцитов, скелетных миобластов, гладкомышечных клеток, ген-модифицированных клеток и клеток костного мозга. Дискутируются возможные механизмы улучшения функции сердца после клеточной кардиомиопластики.

Введение

Сердечная недостаточность (СН) является одной из главных проблем здравоохранения всех экономически развитых стран [1,19]. Для лечения СН в настоящее время используют широкий спектр лекарственных препаратов и немедикаментозных методов, таких как коронарное шунтирование, кардиомиопластика, искусственное сердце, трансплантация сердца, ультрафильтрация и др. Между тем, частота развития и распространенность её в человеческой популяции нарастает, именно поэтому существует необходимость в разработке принципиально новых, доступных и эффективных методов коррекции СН. Развитие биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии сделало клетку не только главным объектом воздействий, но и средством лечения многих заболеваний. Так, уже сейчас для лечения сахарного диабета успешно используется трансплантация (ТП) культур островковых клеток поджелудочной железы, для лечения различных форм печеночной недостаточности применяется экстракорпоральное подключение донорских изолированных гепатоцитов, при болезни Паркинсона нашли применение методы нейротрансплантации, клеточная терапия используется для лечения миодистрофии Дюшенна и т.д. [9,11]. Между тем возможности клеточных технологий в кардиологии остаются малоизученными и нереализованными. Одной из причин этого является отсутствие ясности в представлениях о регенераторных возможностях миокарда.

К вопросу о регенераторных возможностях миокарда

Различные патологические процессы в миокарде (М) (инфаркт миокарда, идиопатическая дилатационная кардиомиопатия и др.) сопровождаются его комплексной адаптивнокомпенсаторной перестройкой - "ремоделированием". Ремоделирование миокарда (РМ) представляет собой процесс последовательных адаптационных структурнофункциональных изменений мышцы сердца в результате ее повреждения. Самая частая причина возникновения СН - острый инфаркт миокарда. При инфаркте миокарда (ИМ) процессы ремоделирования затрагивают как инфарцированный участок, так и здоровый М. Инфарктная зона постепенно растягивается и подвергается рубцеванию, а непораженные участки гипертрофируются и затем дилатируются, приспосабливаясь к новым условиям функционирования. Микроскопически наблюдается удлинение и источение миофибрилл, увеличение расстояния между кардиомиоцитами, миокардиофиброз. [1,5,19].

Отсутствие репродуктивной способности кардиомиоцитов (КМЦ) взрослых млекопитающих давно стало общепризнанным фактом: КМЦ не пролиферируют, замещение дефекта сердечной мышцы происходит без их участия, в основном за счет пролиферации клеток стромы (фибробластов) [27]. Считается, что если возникло повреждение сердечной мышцы, то оно необратимо и проявляется РМ по вышеописанному сценарию, часто закономерно заканчиваясь развитием СН в течение нескольких месяцев или лет [13]. Между тем, в поисках путей уменьшения зоны некроза заслуживают внимания работы Л.В. Полежаева и соавт. [7,8]. Эти авторы показали, что в очаге некроза М под влиянием биомодуляторов и ингибиторов рубцевания на короткий срок появлялись клетки, которые морфологически идентифицировались как слабодифференцированные миобласты. Было констатировано также, что размеры новообразованной рубцовой ткани под влиянием указанной терапии стали значительно меньшими, чем в контроле. Происхождение "миобластов" осталось неясным. Позже Л.В. Полежаевым было показано, что М кроликов, пораженный дифтеритическим токсином, восстанавливал нормальную морфологию под действием гидролизата М, гомогенатов скелетных мышц и других биопрепаратов [6].

По мнению П.П. Румянцева (1982) [12], КМЦ не могут пролиферировать, так как строго ориентированные агрегаты сократительных белков в КМЦ создают препятствия для цитокинеза при митозе; именно поэтому для завершения его необходима обратимая разборка миофибрилл (умеренная дедифференцировка). Из-за отсутствия условий для реализации этих процессов, в частности, при ИМ митотическое деление в КМЦ обычно не идет дальше кариокинеза, и регенерация заканчивается формированием полиплоидных КМЦ. Кроме того, в ткани М не найдены структуры, подобные сателлитным клеткам скелетных мышц, которые являются незрелыми миоцитами и имеют большой потенциал к митотическому делению. Между тем, в желудочках крыс обнаруживается популяция КМЦ в количестве не более 10%, которые могут вступать в митотический цикл (накапливать 3Н-тимидин). Однако показано [25], что митозы КМЦ, заканчивающиеся цитокинезом, редки, располагаются в основном в периинфарктной области и, следовательно, не могут заместить дефект в результате ИМ. Д.С. Саркисов (1979) считает, что уменьшение размеров рубца, показанное в опытах Л.В. Полежаева, связано не с репаративной регенерацией, а с предотвращением вторичных волн некроза М. С позиций разработанной им теории внутриклеточной регенерации [13] сердце относится к органам, в которых при повреждении преобладают не пролиферативные процессы в паренхиме, а фибропластические реакции стромы, которые почти необратимы. С этих позиций следует считать, что дефицит функции КМЦ в М возмещается не за счет их пролиферации, а посредством внутриклеточных гиперпластических реакций.

В исследованиях последних лет [55] показано, что фибробласты потенциально могут приобретать свойства клеток скелетной мускулатуры, если трансплантируются в регенерирующую скелетную мышцу. Видимо, факторами миогенного преобразования фибробластов в этих наблюдениях явились короткодистантные медиаторы регенерирующей мышцы.

Возможный вклад пролиферации КМЦ в пластические процессы М был проанализирован Kajstura et al. (1998) [25] путем измерения митотического индекса КМЦ у пациентов, перенесших трансплантацию сердца, и у больных с дилатационной кардиомиопатией. Расчеты, проведенные этими авторами, показали, что если у 45-летнего здорового человека насчитывается 5.8х109 ядер КМЦ в левом желудочке (ЛЖ), а митотический индекс КМЦ составляет 14 на 106, то 81.2х103 ядер КМЦ одновременно находятся в состоянии митоза. Длительность митоза обычно меньше 1 часа, значит, почти 0.71х109 ядер КМЦ возникает вновь в нормальном М за год в ЛЖ. Так как соотношение 1-, 2- и 4-ядерных КМЦ в ЛЖ составляет 2/1/1 [2], то потенциальный прирост КМЦ может достигать 0.4х109 в год. По данным тех же авторов [25], митотический индекс КМЦ в патологическом сердце (кардиомиопатия) примерно в 10 раз выше, чем в нормальном миокарде, следовательно, пролиферация КМЦ играет важную роль в компенсаторно-восстановительных процессах патологического М.

Проведенные расчеты нельзя считать окончательными, поскольку в литературе отсутствуют сведения о продолжительности жизни КМЦ. Хотя выявленный прирост не может компенсировать массивную гибель КМЦ при ИМ (рубцовая ткань быстрее заместит дефект), следует признать, что частичное возмещение популяции КМЦ путем пролиферации и внутриклеточной регенерации КМЦ может составить определенный регенераторный резерв сердечной мышцы.

Клеточная кардиомиопластика: содержание метода и результаты применения его в экспериментах на животных

Клеточная трансплантация обладает рядом важных преимуществ по сравнению с пересадкой целого органа (сердца) [11]:

  • заместительная клеточная терапия позволяет культуральными методами избавиться от примеси сверхантигенных донорских клеток, которые в первую очередь вовлекаются в процесс иммунного отторжения. Большинство фетальных клеток имеют слабо экспрессированные комплексы главных антигенов гистосовместимости, что на порядок уменьшает уровень посттрансплантационных осложнений [14];
  • фетальный клеточный материал и стволовые клетки имеют большой потенциал роста и пролиферации, выраженную способность к дифференцировке и функционально более активны (фетальные клетки продуцируют факторы роста и регенерации);
  • подсадку клеток можно регулировать по дозам и многократно повторять;
эмбриональные и фетальные клетки и ткани лучше переносят тепловую ишемию и холодовую консервацию; стоимость клеточной трансплантации значительно ниже, чем пересадки органа.

Пересадка клеток в М может применяться для замещения сокращающимися клетками некротических или рубцовых тканей после ИМ, для улучшения нагнетательной функции сердца, регуляции процессов ремоделирования ЛЖ после ИМ (уменьшение степени рубцевания, предотвращение дилатации, улучшение диастолического наполнения, предотвращение расширения области некроза), для лечения дилатационной кардиомиопатии и других целей.

При этом полагают, что восстановление функции М может быть достигнуто путем увеличения количества сократительных клеточных элементов в М и/или путем повышения функционального резерва КМЦ реципиента за счет стимуляции в них процессов внутриклеточной регенерации. Для этих целей используют пересадку в миокард КМЦ, гладкомышечных клеток, ген-модифицированных клеток (фибробласты, скелетные миобласты), проводят целенаправленную экспрессию регуляторных генов клеточного цикла КМЦ (инициирование пролиферации) и используют другие высокотехнологичные методы клеточной терапии [11,31,40]. Так как указанные методики призваны целенаправленно изменить процессы РМ, повлиять на его регенерацию и в конечном счете улучшить функцию сердечной мышцы, то все клеточные технологии в кардиологии стали объединять термином "клеточная кардиомиопластика".

Настоящая работа представляет собой аналитический обзор результатов экспериментальных исследований по ТП в М клеток различных фенотипов. Причем в этих работах изучалось два основных вопроса: 1) приживляются ли пересаженные клетки и как они изменяют структуру М; 2) улучшается ли функция сердечной мышцы после трансплантации.

Морфологическое состояние пересаженных клеток и миокарда реципиентов после трансплантации клеток

Пересадка КМЦ.
Известно, что КМЦ электромеханически интегрированы специализированными контактами в области вставочных дисков, в составе которых имеются fascia adherens (зона прикрепления миофибрилл), щелевые контакты, десмосомы. Десмосомы и fascia adherens выполняют механическую функцию, фиксируя КМЦ между собой, а щелевым контактам отводится роль проводника электрических импульсов. Электромеханическая интеграция между КМЦ - основа скоординированной активности М, за счет которой сердечная мышца действует как единое целое. Ниже мы рассмотрим процессы, происходящие в М после пересадки в него различных типов клеток, с позиций восстановления электромеханической интеграции КМЦ донора и реципиента.

Так, Klug et al (1995) [30] через 10 недель после пересадки фетальных КМЦ описывают появление всех компонентов вставочных дисков между КМЦ хозяина и донорскими КМЦ в М собак, страдающих наследственной мышечной дистрофией.

Leor et al (1996) [34], трансплантируя аллогенную фетальную ткань сердца крысам на различных сроках после ИМ, нашли, что клетки переживали до 65 дней, сохраняли фетальный фенотип и не дифференцировались в зрелые КМЦ. В работах 1996-97 гг. [37,38,39], посвященных пересадке фетальных КМЦ и КМЦ новорожденных крыс, было обнаружено, что культура КМЦ in vitro росла, формируя сердечноподобную ткань и по строению, и по функции. КМЦ содержали организованные саркомеры и были соединены межклеточными контактами, включающими десмосомы и f. adherens. КМЦ регулярно, спонтанно и синхронно сокращались in vitro. Суспензия этих клеток была пересажена в криоповрежденный М и под кожу бедра крыс. Исход пересадки был прослежен в течение 8 [37] и 24 [39] недель при пересадке в М и в течение 3-х месяцев при ТП под кожу [38]. Было отмечено, что пересаженные КМЦ формируют сердечноподобную ткань: происходит увеличение числа клеток, экспрессируются сократительные белки в саркомерах, между новообразованными клетками формируются десмосомы и f. adherens, происходит ангиогенез, уменьшается степень экспансии постинфарктного рубца. Несмотря на применение циклоспорина, в отдаленные сроки после ТП (24 недели) вокруг пересаженных клеток возникали признаки хронического отторжения (лимфоцитарная инфильтрация, уменьшение размеров трансплантата) [39]. Сравнительный анализ показал, что ТП была более успешной при введении фетальных КМЦ (выживало 92% клеток), чем 5-дневных (новорожденных) КМЦ (50%), а клетки, выделенные из 22-дневных (молодых) и 32-дневных (взрослых) крысиных сердец не выживали в сердце после ТП [38]. Указанный факт был подтвержден Reinecke et al. [51], которые обнаружили, что взрослые КМЦ не выживали при пересадке. Однако, более поздние исследования [53] показали, что ТП аутогенных взрослых предсердных КМЦ в криоповрежденный М ведет лишь к переживанию их в рубцовой ткани в течение 5 недель (срок исследования). Пересаженные клетки модифицировали процесс ремоделирования ЛЖ: способствовали предотвращению его дилатации и экспансии рубца, сохранению толщины его стенки. Этими авторами были предприняты попытки пересаживать фетальные КМЦ, выращенные в ячейках вспененного силиконового геля, на поверхность криоповрежденного М и под кожу бедра крыс [36]. Такая механическая поддержка КМЦ была призвана временно обеспечить надлежащие биомеханические и структурные характеристики трансплантата при замещении инфарцированного участка М, пока привитые клетки не сформируют их собственный синцитий и межклеточный матрикс. Через 5 недель после ТП были продемонстрированы переживание пересаженных клеток и ангиогенез в трансплантате, а также выявлена деструкция силиконовой матрицы. Несмотря на то, что в донорском материале не было эндотелиальных клеток, исследователи отметили значительный ангиогенез в трансплантате. Подкожные аллографты сокращались, однако осталось неясным, могут ли трансплантированные КМЦ участвовать в систоле М. При внедрении клеточных конструкций с фетальными КМЦ в рубец М крыс через 7 дней после ИМ [33] через 3 месяца было установлено, что КМЦ в полимерных поддержках продолжают формировать жизнеспособную ткань и стимулируют образование новых сосудов.

Исследовательская группа Matsushita et al (1999) показала в работе [43], что на ранних стадиях ИМ (48 часов), собственные КМЦ в периинфарктных областях формируют тупоконечные культи, частично сохраняя десмосомы; щелевые контакты при этом исчезают. К третьему дню в культях образуются выросты и появляются интегрины, например, b1-интегрины. После 3-х дней, наличие десмосом и f. adherens (несущих механическую функцию) создает благоприятные условия для появления щелевых контактов между выростами КМЦ. В отдаленные сроки (60-90 дни) происходит уменьшение количества отростков, они как бы сливаются между собой, а в целом культя удлиняется. Таким образом, авторами продемонстрирована возможность поврежденных КМЦ частично регенерировать, показано, что КМЦ периинфарктной области сохраняют способность к образованию новых межклеточных контактов. Та же группа изучала распределение клеточных контактов между пересаженными КМЦ и клетками реципиента в зоне границы экспериментального ИМ [44]. При этом было показано, что КМЦ новорожденных крысят, пересаженные в постинфарктный рубец М, через 4 дня образовывали продольные и поперечные щелевые контакты друг с другом и с КМЦ хозяина. Данные Reinecke et al (1999) [51] однако свидетельствуют, что через 2-8 недель после пересадки КМЦ в рубец большинство трансплантированных клеток было отделено от М реципиента грануляционной или рубцовой тканью. Единичные контакты пересаженных клеток с М хозяина имели место только в 40% сердец. Таким образом, пересадка КМЦ в рубцовую ткань в поздние сроки, когда процессы ремоделирования практически завершаются (сроки более 1 мес.), приводит к изоляции пересаженных клеток от остального М; данных об образовании электромеханического единства между трансплантируемыми КМЦ и КМЦ реципиента через рубцовую зону ими не было получено. Эти данные позволяют предположить, что успех пересадки КМЦ в М определяется возможностью взаимодействия их с мышечными клетками реципиента и микроокружением. В этих условиях сохраняется вероятность образования клеточных контактов между КМЦ донора и реципиента. При пересадке же КМЦ в рубец изоляция трансплантированных клеток в рубцовой ткани не позволяет надеяться на возможность участия пересаженных клеток в систоле М реципиента. Вариант с пересадкой КМЦ в пограничную зону ИМ можно считать более перспективным в отношении образования клеточных контактов между КМЦ донора и реципиента.

Пересадка скелетных миобластов
Скелетные миобласты во взрослом организме встречаются в виде сателлитных клеток, они составляют неотъемлемую часть соматической поперечнополосатой мускулатуры, их содержание там составляет 4-8% [66]. Сателлитные клетки, являясь стволовыми клетками, способны пролиферировать и дифференцироваться в зрелые скелетные миоциты, обеспечивают известную степень регенерации скелетной мускулатуры. У плода и новорожденных значительная часть скелетных мышц представлена миобластами. В отличие от сердечных мышечных клеток, волокна скелетной мышцы электрически изолированы друг от друга.

Первые работы по пересадке скелетных миобластов в М относятся к 1993, когда в качестве трансплантата была использована стандартная клеточная линия скелетных мышиных миобластов, клетки которой были пересажены в здоровый М крысы [29]. Переживание клеток наблюдалось в течение 3-х месяцев. Иммуногистохимически к этому сроку было выявлено наличие дифференцированных мышечных трубочек (экспрессия скелетной изоформы тяжелой цепи миозина), электронная микроскопия не показала никаких контактов между клетками трансплантата и хозяина. Характер поглощения меченого тимидина показал, что фактически все пересаженные скелетные миоциты были минимум 2 недели митотически неактивны. Таким образом, в трансплантированных миобластах через 3 месяца были найдены характеристики, типичные для дифференцированных мышечных трубочек.

Chiu et al (1995) [20] произвели пересадку сателлитных клеток в поврежденный М собак. Они выдвинули предположение, что скелетные миобласты могут дифференцироваться в волокна сердечной мышцы и таким образом восстанавливать поврежденный М. Сателлитные клетки были выделены из скелетной мышцы, культивированы, помечены 3Н-тимидином и внедрены в криоповрежденный М. Через 18 недель наличие изотопной метки в пределах плотного рубца подтвердило выживание внедренных клеток. Было показано образование вставочных дисков между пересаженными клетками и наличие центрально расположенных ядер в них, подобных таковым в волокнах сердечной мышцы. Эти наблюдения позволили авторам заключить, что сателлитные клетки подвергаются дифференцировке в сердечноподобные мышечные клетки в соответствующем микроокружении. Исследования Yoon et al (1995) [69] подтверждают эти оптимистические данные; более того, ими были найдены клеточные контакты между КМЦ и миобластами. Murry et al (1996) [46] пересадили в криоповрежденный М миобласты из скелетных мышц новорожденных крыс. Авторы ставили своей целью изучить возможность индукции репарации сердца, прежде чем в нем сформируется рубцовая ткань. Было установлено, что через 3 месяца:

  • пересаженные миобласты пролиферируют и на 3 день начинают формировать многоядерные мышечные трубочки, которые дифференцируются в фенотип зрелых быстрых мышечных волокон;
  • в новообразованной ткани в дальнейшем возникают признаки медленных мышечных волокон;
  • новообразованная мышца может формировать спутниковые стволовые клетки;
  • ex vivo можно стимуляцией вызывать сокращения вновь образованных волокон.
В отличие от вышеописанных работ [20,69], в исследовании Murry et al (1996) [46] ядра в центре мышечных клеток не выявлены, электронная микроскопия не подтвердила наличие вставочных дисков, мышцы были изолированы от М рубцовой тканью. Пересаженные клетки экспрессировали белки, специфические для скелетных мышц и не вырабатывали сердечноспецифическую изоформу тяжелых aцепей миозина. То есть авторы не выявили признаков дифференцировки миоцитов новорожденных крыс в фенотип КМЦ. Taylor et al (1998) [63] показали, что пересаженные аутологичные кроличьи миобласты дифференцируются в одноядерные миоциты, окруженные рубцовой тканью, которая предотвращает прямое взаимодействие их с сердечной тканью. В то же время эти авторы отметили, что миоциты соединяются друг с другом структурами, напоминающими вставочные диски.

По последним данным Reinecke et al (2000) [50], неонатальные скелетные миобласты, пересаженные в М, экспрессируют значительные количества N-cadherin и connexin43 (маркерные компоненты f. adherens и щелевых контактов соответственно), но при дифференцировке они теряют это свойство. В отличие от данных Chui et al., Yoon et al. [20,69], эти авторы не обнаружили в трансплантате клеток с сердечным фенотипом: трансплантаты скелетной мышцы формировали многоядерные миоциты без вставочных дисков, экспрессировали изоформы миозина, специфические для скелетной мышцы, не экспрессировали сердечный aмиозин и белков сердечных межклеточных контактов, имели сократительные свойства, специфические для скелетных мышц. Однако, был доказан факт формирования межклеточных контактов между скелетными миоцитами и КМЦ in vitro. Авторы предполагают, что эти контакты не могут формироваться после пересадки из-за прогрессивного снижения экспрессии N-cadherin и connexin43 на поверхности трансплантированных скелетных миоцитов.

Таким образом, современные исследования не позволяют пока однозначно ответить на вопрос: дифференцируются ли миобласты в миокарде реципиента в КМЦ и образуются ли при этом контакты между КМЦ реципиента и миобластами донора.

Пересадка клеток костного мозга и производных эмбриональных стволовых клеток Красный костный мозг (ККМ) взрослых млекопитающих, и человека в том числе, содержит стволовые клетки. Среди них выделяют гемопоэтические стволовые клетки, способные пролиферировать и дифференцироваться в элементы крови, и мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые могут развиться в мезенхимальные ткани: мозг, хрящ, мышцы, связки, сухожилия, жировую ткань [48,49]. Показано, что различные мезенхимальные клетки обладают способностью к миогенному преобразованию. Так, в 1995 году Salvatori et al (1995) [55] сообщили, что фибробласты линии 10T1/2, культивируемые с миобластами линии C2C12 или скелетными миобластами цыплят, дифференцируются в мышечные трубочки (1-10% от всей популяции). Этого не происходило, когда они кокультивировались с другими клетками (например, с клетками феохромоцитомы). Миогенное преобразование фибробластов линии 10T1/2 наблюдалось и in vivo после инъекции их в регенерирующую мышцу. Исследования Ferrari et al (1998) подтверждают, что костномозговые клетки мышей, введенные в скелетную мышцу, могут участвовать в процессе ее регенерации и формировать полностью дифференцированные мышечные волокна [22]. Makino et al (1999) [42] получили кардиомиогенную клеточную линию из мышиных клеток стромы костного мозга, в которых после обработки 5-азацитидином in vitro были индуцированы процессы дифференцировки в КМЦ. Эффективность обработки составила ~30%. Полученные клетки экспрессировали множество специфических для КМЦ генов, имели фенотип фетальных желудочковых КМЦ. Дифференцированные таким образом КМЦ были связаны между собой вставочными дисками, формировали мышечные трубочки, спонтанно сокращались, имели КМЦ-подобную ультраструктуру, включая типичные саркомеры, центрально расположенное ядро, множественные гранулы гликогена и митохондрии. Мышечные трубочки генерировали потенциалы действия, напоминающие таковые у желудочковых КМЦ.

Прокультивированные в течение 7 дней в среде, содержащей 5-азацитидин, аутологичные клетки ККМ были пересажены в рубцовую ткань после экспериментального ИМ, вызванного криоповреждением у крыс [65,66]. После ТП в донорских клетках ККМ in vivo экспрессировался сердечно-специфический тропонин I. Количество капилляров в области некроза после пересадки увеличилось по сравнению с контролем. ТП ограничила экспансию рубца и желудочковую дилатацию. Ангиогенез в трансплантате происходил благодаря пересаженным клеткам.

Wang и соавт. (2000) [67] выдвинули гипотезу, что микроокружение в М создаст определенные условия и сигналы для кардиомиогенной дифференцировки МСК. В их исследованиях крысиные МСК после культивирования и удаления большинства гемопоэтических стволовых клеток были пересажены в М и дифференцировались в КМЦ, образовывали щелевые контакты.

Как видно, в отличие от миобластов, МСК, обладающие более выраженной плюрипотентностью, сравнительно легче подвергаются кардиомиогенной дифференцировке.

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) также могут служить источником донорских КМЦ, подходящих для пересадки в сердце [28,67]. ЭСК - тотипотентные клетки, способные развиваться в любой вид ткани. Они существуют на ранних стадиях эмбриогенеза (зародышевый узелок). В работе Klug et al. (1996) [28] тотипотентные ЭСК были генетически модифицированы для того, чтобы в клеточной массе преобладал кардиомиогенный путь их дифференцировки. Была сформирована линия ЭСК, несущая ген сердечной тяжелой цепи миозина. Иммуногистологические и ультраструктурные исследования показали, что полученные таким способом КМЦ были высоко дифференцированы (99% клеток содержали миозин, миофибриллы, вставочные диски) и формировали трансплантаты в сердцах взрослых мышей, прослеженные в течение 7 недель после их имплантации.

Пересадка гладкомышечных клеток
Li et al (1999) [35] пересаживали в сердце в очаг некроза месячной давности гладкомышечные клетки, выделенные из желудка эмбрионов крыс. По их данным, через 4 недели эти клетки обнаруживались в М; они способствовали росту кровеносных сосудов в зоне рубца, уменьшению размеров рубца, а также ограничению дилатации ЛЖ.

Yoo et al (2000) [68] пересаживали аутологичные гладкомышечные клетки в сердце хомяков с наследственной дилатационной кардиомиопатией. Авторы не задавались целью проследить длительность выживания клеток в М, однако, ими было обнаружено, что после однократного введения гладкомышечные клетки распространялись на 25-35% площади ЛЖ и ограничивали дилатацию камер сердца. Таким образом, есть основания полагать, что гладкомышечные клетки, будучи дифференцированными и без выраженной пролиферативной активности, не могут использоваться в качестве замены КМЦ, но могут служить модуляторами РМ.

Пересадка ген-модифицированных клеток
Soonpaa et al. (1994) [59] были одними из первых, кто сообщил о возможности ТП в М фетальных КМЦ от трансгенных животных. Ими были использованы фетальные КМЦ, взятые у трансгенных мышей, несущих дополнительный ген тяжелой цепи сердечного миозина и маркерный ген, кодирующий b-галактозидазу (метка). В М крыс было показано переживание трансплантированных клеток в течение 2-х месяцев после пересадки и образование вставочных дисков, соединяющих привитые фетальные КМЦ и КМЦ хозяина. Пересаженные КМЦ были высоко дифференцированы: миофибриллы формировали саркомеры, имелись многочисленные межклеточные контакты и митохондрии, были выявлены двуядерные, b-галактозидазо-позитивные клетки. Поскольку двуядерность - характеристика взрослых КМЦ грызунов, то все эти наблюдения служили свидетельством предельной дифференцировки пересаженных клеток. Дифференцировка скелетной мышцы регулируется экспрессией семейства генов, одним из которых является MyoD. Tam et al (1995) [62] трансфецивали сердечные фибробласты новорожденных крыс геном MyoD с помощью ретровирусного вектора и наблюдали преобразование фибробластов в клетки скелетной мышцы in vitro. Через 10 дней после трансфекции экспрессия протеина MyoD была продемонстрирована ими в 95% клеток.

В работе [45] также было показано, что сердечные фибробласты могут быть трансфецированы аденовирусным вектором с MyoD. В результате экспрессии соответствующих белков фибробласты при введении их в зону грануляционной ткани М после экспериментального ИМ приобретали фенотип клеток скелетной мышцы.

Исследования Toma et al (1999) [64] свидетельствуют, что человеческие МСК, трансфецированные геном MyoD с помощью рекомбинантного аденовируса, стали позитивны в отношении MyoD, десмина, саркометрического миозина, тропонина I и a-актинина (последний белок свидетельствует о возникновении связей между саркомерами, однако маркерного белка - connexin43 -обнаружено не было). Новообразованные клетки были удлинены и иногда становились многоядерными. Они реагировали со специфическими антителами медленной изоформы человеческого миозина, но не с быстрой изоформой. Эти результаты показывают, что МСК могут быть эффективно дифференцированы в фенотип поперечнополосатой мышцы после принудительной экспрессии гена MyoD. Экспрессия гена медленной изоформы тяжелой цепи миозина свидетельствует, по мнению авторов, о том, что эти клетки могут быть способны выполнять функции КМЦ.

Дифференцировка клеток - результат деятельности многих семейств генов, механизм взаиморегуляции которых до конца не расшифрован. Поэтому клетки с каким-либо одним экспрессированным геном, который в норме активен только у дифференцированных КМЦ, не могут считаться их полноценной заменой. Однако может оказаться полезной пересадка клеток, трансфецированных генетическими конструкциями, ответственными за синтез продуктов, регулирующих функцию М.

Функциональное состояние сердца после клеточной кардиомиопластики
По данным большинства исследователей многие показатели функциональной активности сердца достоверно улучшались после пересадки в М различных типов клеток. Однако ни в одном исследовании эти результаты не интерпретировались как следствие сократительной активности пересаженных клеток, даже если те сокращались в культуре [16,28,38] и/или образовывали контакты с М реципиента [43,44,69]. Так, по мнению Taylor et al (1998) [63], миобласты непосредственно не улучшают нагнетательную функцию сердца, но уменьшают ригидность зрелого рубца. В результате систолическая функция М все же улучшается после ТП. Аналогичные изменения наблюдали Atkins et al (1999) [17], Huteheson et al (1998) [24]: через 3 недели после введения аутогенных скелетных миобластов в инфарцированную зону М кроликов было отмечено улучшение и систолической, и диастолической функции ЛЖ. Сравнив эффективность применения скелетных миобластов и фибробластов, эти исследователи установили, что ТП обоих типов клеток улучшает диастолические свойства М. Использование миобластов, по их мнению, более предпочтительно, так как эти клетки способствовали более отчетливому улучшению сократительных свойств миокарда, благоприятно изменяя геометрию М. При использовании фибробластов возникает опасность того, что продукция коллагена этими клетками может в конечном счете увеличить размеры и ригидность сформированного рубца.

Очевидно, что пересаженные миобласты не могут непосредственно участвовать в выполнении сократительной функции. Происходит это в силу нескольких причин [45]:
  • скелетная мышца не обладает автоматизмом;
  • скелетная мышца имеет очень короткую продолжительность потенциала действия и короткий рефрактерный период, поэтому на фоне нормальной электрической активности сердца она может формировать тетанус;
  • миобласты не образуют никаких контактов с клетками М хозяина [20,29,46,63].
  • Одновременно указывается на наличие структурных предпосылок для участия скелетной мышечной ткани и в механической, и в электрической систоле М:
  • КМЦ, примыкающие к зоне инфаркта, формируют новые вставочные диски [43,44], и это может означать их потенциальную способность формировать контакты с другими клеточными типами;
  • были обнаружены вставочные диски между миобластами и КМЦ в культуре [50] и после ТП миобластов в М [69];
  • щелевые контакты позволяют КМЦ стимулировать клетки скелетной мышцы и вызывать синхронизированные с сердечным ритмом сокращения [50];
  • быстрые мышечные волокна пересаженных миобластов могут трансформироваться в устойчивые к утомлению медленные мышечные волокна. Поэтому высказывается мнение [46], что новообразованная мышца может подходить для работы сердца.

При ТП фетальных КМЦ в поврежденный миокард [37] было обнаружено явное улучшение скорости нарастания давления в ЛЖ, ударного объема изолированного сердца по сравнению с контрольными группами. Пересадка КМЦ опосредованно увеличивает фракцию изгнания и объем сердечного выброса по данным УЗИ (за счет уменьшения размеров инфарцированного участка) [56]. ТП взрослых аутологичных КМЦ увеличила давление, развиваемое ЛЖ в экспериментальной группе по сравнению с контролем [53]. Шевченко Ю.Л. (1999) [16] также показывает, что при ТП фетальных КМЦ в М крыс после перевязки коронарных артерий происходит постепенная нормализация ЭКГ, что косвенно подтверждает встраивание имплантированных КМЦ в архитектонику сердца взрослого животного.

Пересадка аутологичных клеток ККМ, обработанных 5-азацитидином, приводила к увеличению пикового систолического давления и улучшению сократимости поврежденного М относительно контрольных групп [66]. ТП аутологичных гладкомышечных клеток у хомяков с наследственной кардиомиопатией [68] также благоприятно воздействовала на сократимость и активное расслабление М. Вклад пересаженных гладкомышечных клеток в активное сокращение, по мнению авторов, маловероятен, из-за неорганизованного их расположения в М после ТП. Исследователи связали изменения диастолической функции М с увеличением толщины стенки ЛЖ, которая ограничивает желудочковую дилатацию, а улучшение систолической функции - с усилением ангиогенеза, в результате которого, возможно, улучшилась региональная перфузия ЛЖ.

Пересадка гладкомышечных клеток также улучшает функцию сердца, так как и систолическое, и диастолическое давление в камере ЛЖ было большим, чем в контроле [35]. Поскольку формирование рубца после экспериментального ИМ у крыс в целом завершается через 1 месяц [4,5,56], то оценку воздействия ТП различных типов клеток на функцию М следует производить на фоне относительной стабилизации процессов РМ. В то же время нет сомнения в том, что эффективность клеточной терапии возрастает при более раннем ее применении, до образования в сердечной ткани ригидного соединительнотканного рубца. Однако в этом случае исследователь рискует интерпретировать улучшение показателей работы сердца как ускорение процессов репарации, и наоборот, реальную активацию восстановительных процессов принять за достоверное улучшение функции М. Поэтому обязательным подтверждением функциональных тестов должен быть морфологический контроль.

Проблемы клеточной кардиомиопластики
В доступной нам литературе мы не нашли однозначного ответа на вопрос, какой же тип клеток лучше использовать для более эффективного восстановления функции М. Исследованию этого вопроса посвящено совсем немного работ [24,54]. В работе [54] авторы пересадили в М три типа клеток: фетальные КМЦ, фибробласты и гладкомышечные клетки. Пересаженные фибробласты способствовали формированию самого толстого рубца, то есть оказывали наиболее выраженное влияние на процесс ремоделирования ЛЖ, но функцию сердца улучшали незначительно. Кроме того, есть мнение [24], что жесткость новообразованного фиброзного рубца может впоследствии уменьшить диастолическое наполнение ЛЖ. Более значительный прирост функциональных показателей был отмечен после пересадки КМЦ и гладкомышечных клеток, причем, после пересадки КМЦ улучшение функции М было более значительным, чем при ТП гладкомышечных клеток. Выявленные различия авторы объяснили потенциальной возможностью активного сокращения и расслабления пересаженных КМЦ, тогда как гладкомышечные клетки ведут себя пассивно при сокращениях М.

В экспериментах по пересадке клеточного материала в М удалось относительно подробно описать структурные перестройки в сердечной мышце после ТП, и эта информация позволяет обсуждать несколько эффектов.

Показано, что привнесенные в М клетки выделяют различные биоактивные вещества: ростовые факторы, цитокины и др. Особенно это касается стволовых (в том числе и фетальных) клеток, основные эффекты от имплантации которых выражаются в мощной индукции репаративных процессов в месте повреждения [10,11,14,34]. В то же время, микроокружение, в которое попадают введенные клетки, также оказывает влияние на их развитие. Так, МСК под влиянием микроокружения развиваются в фенотип КМЦ [20,67], однако механизмы и сигналы такой трансформации пока не расшифрованы. Эмбриональные миоциты в культуре могут трансформироваться в фенотип волокон Пуркинье в ответ на паракринный сигнал: эндотелин (цитокин, секретируемый эндотелиальными клетками) способствовал такому превращению миобластов после добавления его в культуральную среду [23]. Кроме того, эндотелиоциты выделяют другие биоактивные вещества (окись азота, натрийуретические пептиды, ростовые факторы и др.), которые, как было показано [32], в культуре взрослых КМЦ стимулируют синтез белка, индуцируют миофибриллогенез.

Пересаженные клетки (фетальные КМЦ и гладкомышечные элементы) стимулируют ангиогенез [34,35], который развивается в толще и вокруг трансплантата [36-39,65,66]. Между тем, около привитых клетоксателлитов кровеносных сосудов было замечено очень немного [63].

Значительное влияние клеток на ремоделирование М отмечают практически все исследователи, проводящие эксперименты на модели ИМ. По их данным, улучшаются эластические свойства рубца: он становится менее ригидным, улучшая кровенаполнение ЛЖ в диастолу, меньше мешает полноценной систоле; уменьшает интенсивность рубцевания (что предотвращает экспансию рубцовой ткани) [25,37-39,53,65,66] и размеры рубца [35]. Клеточная ТП способствовала также профилактике дилатации ЛЖ. Ни в одном исследовании не было показано, что пересаженные клетки замещают собой рубцовую ткань.

Пересаженные клетки в большинстве работ формировали устойчивые ростки новообразованной ткани, которая интегрировалась с М хозяина в различной степени. В одних работах наблюдали островки, окруженные рубцовой тканью [63], в других отмечено появление щелевых контактов донорских клеток с М реципиента [50,67], но активное участие в систоле сократимых по морфологическим критериям донорских клеток однозначно не доказано; отмечено лишь достоверное улучшение систолических показателей. Для активного участия пересаженных клеток в систоле ЛЖ должно соблюдаться несколько условий:

  • клетки должны содержать сократительные структуры;
  • между клетками должны присутствовать вставочные диски с щелевыми контактами для проведения потенциалов возбуждения к пересаженным клеткам от КМЦ хозяина;
  • должна отсутствовать реакция отторжения;
  • пересаженные клетки должны способствовать репарации поврежденного участка (замещение соединительной ткани и формирование полноценной мышечной архитектоники).

Сложная волоконная геометрия сердечной мышцы является основой слаженной работы М [2,3]. Между тем, по данным Murry et al. (1996) [46], мышечные волокна пересаженных клеток после пересадки оказывались расположенными преимущественно вдоль короткой (поперечной) оси сердца, повторяя ту же ориентацию, какую формируют фибробласты и коллагеновые волокна в процессе рубцевания. Вероятно, что такой тип ориентации возникает под воздействием механической равнодействующей, под влиянием которой именно так ориентируются незакрепленные привнесенные клетки. Однако, в исследовании [44] было обнаружено, что направление пересаженных КМЦ идет параллельно расположению КМЦ реципиента. Вводя клетки инъекционно, приходится констатировать, что определенная их часть, иногда значительная, гибнет от ишемии, так как в месте инъекции отсутствует необходимый уровень васкуляризации, который формируется позже. Так, после пересадки изогенных новорожденных КМЦ в криоповрежденный крысиный М через 18 часов погибало до 45% трансплантируемых клеток. Пул оставшихся клеток в динамике нарастал довольно медленно, если вводилось 3-10 млн. клеток, а при пересадке 10-25 млн. КМЦ их количество далее не увеличивалось [70]. Авторы видят причины этого в тепловом шоке пересаженного материала. Для решения проблемы реперфузионного повреждения клеток исследователи [61] подвергали культуру миобластов своеобразной "тренировке" перед ТП: путем воздействия высоких температур и гипоксии. Будучи пересаженными в сердце, эти клетки оказались более жизнеспособными. Не имея стройной теории механизма ремоделирующего действия трансплантированных клеток, авторы сходятся в том, что в результате пересадки можно достичь: 1) предупреждения развития постинфарктной аневризмы; 2) ускорения процессов ремоделирования ЛЖ; 3) предотвращения распространения очага некроза; 4) улучшения диастолических свойств М; 5) улучшения нагнетательной функции сердца.

Заключение.

В настоящее время возможности клеточной кардиомиопластики путем ТП клеток различных фенотипов в М интенсивно изучаются. Взрослые КМЦ имеют слабо выраженную способность к росту in vitro и in vivo. В то же время фетальные клетки (в частности, фетальные КМЦ) имеют больший потенциал к росту как в культуре, так и в организме реципиента по сравнению со взрослыми КМЦ, выделяя при этом в окружающие ткани биоактивные вещества, индукторы регенерации КМЦ и РМ. Между тем, использование аллогенных фетальных КМЦ в клинической практике ограничено по этическим соображениям и из-за необходимости использовать иммуносупрессию, которая к тому же не гарантирует длительного переживания пересаженного материала.

Для клинического применения предпочтительнее аутологичный материал, в качестве которого могут быть использованы скелетные миобласты и МСК костного мозга, а также генмодифицированные клетки. Генетически измененные клетки могут формировать мышечный фенотип в несократимых клетках, например, в фибробластах или МСК, а также экспрессировать необходимые ростовые факторы, и вещества, которые также улучшают функцию КМЦ миокарда реципиента.

Выбор клеточного материала определяется целями ТП. Для более эффективного восстановления систолической функции сердца необходимы мышечные клетки, которые способны полноценно встроиться в структуру М реципиента. Такими клетками могут стать генмодифицированные аутологичные фибробласты, скелетные миобласты, которые будут экспрессировать характерные для КМЦ белковые молекулы; а также МСК, в которых можно индуцировать дифференцировку в КМЦ.

Пересадку клеток в М можно использовать для ограничения роста зоны ИМ, улучшения механических свойств рубцовоизмененной мышцы сердца, улучшения васкуляризации М. Используемые для этих целей клетки должны прежде всего длительно выделять биологически активные вещества и уменьшать степень фиброза М. Аутологичные гладкомышечные клетки, скелетные миобласты удовлетворяют этим условиям. Для тех же целей можно трансфецировать различные типы пересаживаемых клеток генами, ответственными за выработку продуктов, блокирующих апоптоз, усиливающих ангиогенез, улучшающих сократимость М и предотвращающих его ишемию.

Комбинация клеток с различными биосовместимыми материалами для механической поддержки структуры трансплантата позволит использовать такие конструкции для замещения различных дефектов в М, например, при травмах сердца или для профилактики образования постинфарктных аневризм. Путь введения клеток определяется характером поражения М. При очаговой патологии (ИМ) клетки целесообразно вводить инъекционно непосредственно в очаг повреждения и/или в пограничную зону. При диффузном характере поражения сердечной мышцы (кардиомиопатия) такие методики, видимо, не будут столь эффективны. В таких случаях предлагается внутрикоронарный путь введения, позволяющий пересадить клетки в М более равномерно [60].

Срок пересадки клеток определяет ее эффективность. Пересаживая клетки в "свежий" очаг некроза, можно надеяться на уменьшение степени рубцевания, стимуляцию ангиогенеза, предотвращение вторичных волн некроза М и даже на частичное восстановление нормальной структуры сердца. Пересадка клеток в зрелый рубец улучшит биомеханику расслабления М.

Таким образом, в настоящее время клеточная трансплантология рассматривается большинством исследователей как альтернатива органной ТП и, повидимому, в обозримом будущем начнет применяться в клинической практике для улучшения прогноза у больных с СН различного генеза (ИМ, ранения сердца, дилатационная кардиомиопатия и др.).

Потапов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А.
(НИИ Трансплантологии и Искусственных органов МЗ РФ)

По материалам: http://www.med-tech.com.ua/

Смотрите также:

У нас также читают: